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头孢洛扎硫酸盐(ceftolozane sulfate)是由Astellas Pharma研制，并于2007年由Calixa Therapeutics获得其开发权。2009年12月Cubist Pharmaceuticals将Calixa Therapeutics收购，获得头孢洛扎硫酸盐(又称CXA-101)，以及CXA-201(ceflolozane/tazobactam)联合用药的开发及商业化权利[1-3]。其中，头孢洛扎硫酸盐的结构式如图1所示。图1 头孢洛扎硫酸盐的结构式Fig.1 Structure of ceftolozane sulfate而头孢洛扎是一种新型静脉给药的“第五代”头孢菌素类抗生素，其耐受性良好，抗菌谱较广，对革兰阳性菌和革兰阴性菌都具有较强的活性，在体内外试验中对铜绿假单胞菌以及多重耐药铜绿假单胞菌均显示出强效的抗菌活性[4-5]。且头孢洛扎与β-内酰胺酶抑制剂tazobactam组成复方静脉注射剂，于2014年12月获得了美国食品药品监督管理局(FDA)的批准上市，商品名为Zerbaxa?，是第四个被FDA批准，并指定为合格的感染疾病产品(QIDP)的新抗菌药产品，获得现有抗生素激励(GAIN)法规规定的为期5年的专营权延长，呼吸机相关性细菌性肺炎(VABP)和医院获得性细菌性肺炎(HABP)的治疗正进行Ⅲ期临床研究[6]。该品上市后为临床上治疗多重耐药菌的感染提供新的选择。目前，也有相关专利及文献报道了头孢洛扎硫酸盐的合成方法[7-9]。方法总结如下：合成方法1(图2)：首先将二苯甲基保护的母核结构作为起始原料之一，7-位侧链噻二唑化合物首先用Boc保护氨基后，再用三氯氧磷将羧基活化为酰氯，之后与上述的母核进行缩合反应得到中间体化合物；然后再与侧链吡唑化合物进行反应，最后经过脱保护反应制得头孢洛扎三氟乙酸盐，但是脱保护反应的摩尔收率很低，只有约5%；头孢洛扎三氟乙酸盐再经过过柱纯化制得头孢洛扎硫酸盐，合成路线见图2。图2 头孢洛扎硫酸盐的合成路线1Fig.2 Synthetic route 1 of ceftolozane sulfate合成方法2(图3)：是以将母核与7-位侧链噻二唑化合物缩合反应完的化合物为起始原料，再与侧链吡唑化合物进行反应，侧链吡唑化合物上的氨基先用三苯甲基进行保护。最后进行的脱保护反应收率比较低，得到的头孢洛扎三氟乙酸盐经过过柱纯化得到头孢洛扎硫酸盐，合成路线如图3所示。合成方法3(图4)：与上述报道的两种制备方法的合成路线有所不同，首先将侧链吡唑化合物与对甲氧基苄基(PMB)保护的母核进行反应得到中间体化合物，之后与7-位侧链噻二唑化合物进行缩合反应得到产物。该方法是以水杨醛亚胺头孢菌素衍生物为起始原料。其首先与用三苯甲基进行保护的侧链吡唑化合物进行反应得到水杨醛亚胺吡唑中间体化合物。之后7-位侧链噻二唑化合物活化成甲磺酸酐化合物与上述中间体化合物进行缩合反应，之后使用三氟乙酸/苯甲醚体系进行脱保护反应，得到头孢洛扎三氟乙酸盐，最后将其过柱纯化为头孢洛扎硫酸盐。其中脱保护反应的的摩尔收率较低，只有约15%，而且文献报道中的最后一步纯化反应没有给出具体收率，合成路线如图4所示。图3 头孢洛扎硫酸盐的合成路线2Fig.3 Synthetic route 2 of ceftolozane sulfate图4 头孢洛扎硫酸盐的合成路线3Fig.4 Synthetic route 3 of ceftolozane sulfate上述报道中的3种制备头孢洛扎硫酸盐的方法，其总收率均较低，而且纯化步骤均使用了过柱的方法，限制工业化规模生产。所以，改进头孢洛扎硫酸盐的制备方法，使之能够工业化生产，具有较大的社会经济效益。参考以上这些合成方法，改进后的合成路线如图5所示，具体步骤如下：首先7-位侧链噻二唑化合物TATD与草酰氯反应制得化合物1，再与对甲氧基苄基保护的母核ACLE·HCl进行缩合反应得到化合物2，然后化合物2与侧链吡唑化合物进行反应，并在三氟乙酸/苯甲醚条件下进行脱保护反应得到化合物3，最后经过纯化析晶得到头孢洛扎硫酸盐。改进后的工艺最后纯化过程是不需要过柱的，即可制得头孢洛扎硫酸盐。本文提供的方法不仅提高了各中间体收率，降低了生产成本，而且不需要过柱子的操作，更适合工业化生产。1 实验部分1.1 仪器与药品实验仪器Varian 400-MR型核磁共振波普仪，梅特勒托利多FE28-Standard实验室台式pH计酸度计，Agilent 1200/1260高效液相色谱仪，AR1140电子天平，ALPHA傅里叶变换红外光谱仪等。主要原料母核ACLE·HCl(上海乔木化学科技有限公司)，7-位侧链噻二唑化合物TATD(上海闯欣医药科技有限公司)，侧链吡唑化合物UBT(上海闯欣医药科技有限公司)，其它溶剂与试剂均来源于上海国药集团 合成过程图5 改进后的头孢洛扎硫酸盐合成路线Fig.5 The improved synthetic route of ceftolozane 化合物1的合成将TATD(80g,0.242mol,1eq)溶解在400mL二氯甲烷中，并降温至-12℃。将草酰氯(24.92mL,0.290mol,1.2eq)滴加至反应液中，耗时20min。滴加完毕后，继续控温-12℃，搅拌反应2h。反应结束后，将反应液滴加至1.2L异丙醚中，控温-10～0℃，耗时2h。之后继续控温-10～0℃，搅拌析晶3h。析晶结束后，过滤，得到湿品置于35℃真空干燥，得到干品82.4g化合物1，摩尔收率为97.6%。1H NMR(400MHz,THF-D8)：δ7.59(bs,2H,NH2)，1.52(s,6H,CH3)，1.42(s,9H,CH3)；ESI-MS：m/z348.1[M]+1.2.2 化合物2的合成室温下，将化合物1(70g,0.201mol,1.0eq) 与ACLE-HCl(85g,0.210mol,1.04eq)溶解在500mL乙腈中，溶解完全后降温至-10℃。控温(-10±2)℃，将吡啶(19.91g,0.252mol,1.25eq)滴加至上述反应液，耗时30min。加完后，反应液继续控温(-10±2)℃，搅拌反应3h。反应结束后，用250mL甲苯与200mL 5%稀硫酸的混合液进行淬火反应，控温-8℃以下。加完后，将双相料液升温至20～25℃，搅拌15min，静置分层。收集有机层，并往有机层中加入200mL 5%稀硫酸水溶液搅拌洗涤，控温25℃以下。之后控温25℃，搅拌15min，静置分层。收集有机层再依次用150mL的10%氯化钠溶液与150mL纯化水进行洗涤，控温25℃搅拌15min，静置分层。有机层浓缩至体积约300mL。将浓缩残留物料降温至20℃，并加入晶种。控温20℃，搅拌析晶2h。之后，往料液里滴加700mL甲苯，耗时3h，控温20℃。加完后，继续控温20℃，搅拌2h。过滤，滤饼依次用200mL乙腈/甲苯混合液洗涤(乙腈为5%，体积比)、300mL甲苯淋洗。将湿品置于真空下，40℃干燥得到128.7g化合物 2，摩尔收率94%。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ 9.52(d,J=8.5Hz,1H,NH),8.18(bs,2H,NH2),7.36(d,J=8.7Hz,2H,CH),6.94(d,J=8.7Hz,2H,CH),5.90(dd,J=4.9Hz,8.5Hz,1H,CH),5.10～5.28(m,2H+1H,CH2+CH),4.46～4.54(m,J=16Hz,2H,CH2),3.76(s,3H,CH3),3.45～3.70(m,2H,CH2),1.44(s,6H,CH3),1.39(s,9H,CH3); ESI-MS：m/z680.15[M] 化合物3的合成将化合物2(67g,0.098mol,1eq)，侧链吡唑化合物UBT(54.77g,0.101mol,1.03eq)溶解在570mL四氢呋喃中。控温1 5 ℃，分6 ～8 次加入碘化钾22.7g(0.137mol,1.4eq)，搅拌反应10h。反应结束后，浓缩至体积约300mL。通过在蒸馏过程中以恒定速率加入450mL乙酸乙酯进行溶剂转换以除去四氢呋喃，以保持约300mL的料液体积。之后，往反应液里依次加入350mL乙酸乙酯，180mL的10%氯化钠溶液，控温15℃搅拌30min，静置分层。分层得到有机层，浓缩至体积约为300mL。控温10～20℃，先往反应液料液中加入100mL苯甲醚，再缓慢滴加入400mL三氟乙酸(TFA)，滴加耗时1h。加完之后，控温20℃搅拌反应3h。反应结束后，降温至5℃，往料液中滴加入600mL甲基叔丁基醚，耗时2h。之后控温5℃搅拌1h，过滤，滤饼用甲基叔丁基醚200mL洗涤，湿品置于真空35℃条件下，干燥得到68.8g化合物3，摩尔收率90%。ESI-MS：m/z667.2[M]+ 头孢洛扎硫酸盐的合成控温20～25℃，将化合物3(50g,0.064mol)与350mL混合溶剂(乙腈:水=1:1,V/V)搅拌混合均匀。之后降温至15℃，往料液中缓慢滴加50%稀硫酸12.5g，控温15～20℃，pH0.1～1.0，搅拌至料液溶清。料液经过0.22μm过滤器过滤，并将滤液降温至12℃。往料液中加入适量头孢洛扎硫酸盐晶种，反应液控温12℃继续搅拌析晶3h。控温12℃，将400mL乙腈缓慢滴加至反应液中，耗时2h。滴加完后，将用三乙胺(5.33g,1.0eq,7.35mL)加至反应液中，调节pH(1.5～3.0)，之后反应液继续搅拌3h。过滤，滤饼用100mL混合溶剂(乙腈:水=4:1,V/V)与80mL丙酮淋洗。湿品在真空下，30℃干燥得到46.5g头孢洛扎硫酸盐，摩尔收率95%。1H NMR(400MHz,D2O)：δ 7.89(s,1H,CH),5.85(d,J=4.8Hz,1H,CH),5.23(d,J=4.8Hz,1H,CH),5.19(d,J=14.7Hz,1H,CH2),4.96(d,J=14.7Hz,1H,CH2),3.70(s,3H,CH3),3.47(t,J=5.8Hz,1H,CH2),3.45(d,J=17.5Hz,1H,CH2),3.21(d,J=17.8Hz,1H,CH2),3.13(t,J=5.7Hz,1H,CH2),1.52(s,3H,CH3),1.51(s,3H,CH3); ESI-MS：m/z667.2[M]＋；IR(KBr)3353,3183,1778,1652,1558,1403,1321,1143,1118,997,619 cm-1。2 分析讨论2.1 化合物1的合成该步骤主要是将7-位侧链噻二唑化合物TATD进行活化，将其羧基转化成酰氯，使之更容易与母核ACLE·HCl进行缩合反应，提高收率及纯度。尝试过文献专利报道的甲磺酰氯或者三氯氧磷进行活化反应，但是收率均较低。该步骤反应使用草酰氯进行酰氯化反应，操作比较简单，最终得到的产物纯度及收率均较高，关键是保证反应是无水条件，否则草酰氯遇水会分解，导致收率及纯度降低。反应结束后，将料液加至异丙醚中，速度不能过快，否则析出来的固体会团聚，无法正常析出 化合物2的合成将以母核ACLE·HCl与7-位侧链化合物1为起始原料，在缚酸剂吡啶的存下，进行缩合反应得到化合物2。研究该反应时，使用不同的缚酸剂(各种有机碱包括吡啶、三乙胺、二乙胺、二异丙胺、哌啶及吡咯)对反应结果的影响，具体见表1。最后发现，使用吡啶作为缚酸剂时，反应得到的产物的收率及纯度经综合考虑是最佳的。该反应采用了多次洗涤，是为了去除料液中多余的有机碱及反应生成的盐，使得到的化合物2纯度更高。最后将甲苯缓慢滴加至料液中，滴加速度一定缓慢，否则会出现爆析的现象，降低产品纯度。表1 不同有机碱对合成化合物2的影响Tab.1 Effect of different organic bases on synthesis of compound 2有机碱 化合物 2的纯度/% 化合物 2的摩尔收率/%吡啶 99.16 94.00三乙胺 99.22 89.50二乙胺 98.73 87.56二异丙胺 98.52 90.25哌啶 99.05 92.12吡咯 95.00 87.692.3 化合物3的合成化合物2与侧链吡唑化合物UBT反应时，需要催化剂碘化钾存在下，才可反应得较完全。碘化钾必须少量多次加，一次性加入反应效果不佳，原料残留较大。反应得到的过渡态再使用三氟乙酸/苯甲醚体系进行脱保护基反应，能够得到纯度与收率较高的产品。研究该脱保护基反应时，使用不同反应体系，比如氯化氢及四氯化钛，使用四氯化钛时，最终的钛盐对环境污染较严重，且原料反应不完全，导致收率低；使用氯化氢时，由于酸性比较强，反应比较剧烈，脱去保护基的同时，可发生头孢母核3位和4位基团裂解的反应，容易产生副产物和杂质，影响了产品的纯度。后期反应得到化合物3，可在有机溶剂中析出，使用异丙醚与甲基叔丁基醚。在异丙醚体系中析出的固体较黏，容易成团，无法正常析出；而在甲基叔丁基醚体系中析出的晶型更好，颗粒分散得较均匀，最终得到的产品纯度也较高 头孢洛扎硫酸盐的合成文献报道的方法均需要通过分离柱，才能纯化合成头孢洛扎硫酸盐。过柱操作直接影响了大规模生产。而本实验方法则采取了常用的混合溶剂中析晶方式纯化，最后能够得到较高纯度的产品。该步骤反应的关键在于调节析晶时pH值，具体见表2。研究发现，当析晶体系长期处于pH＜1.5时，产品纯度较低，分析其原因可能是在强酸性体系，头孢母核发生裂解反应，容易产生杂质，pH值较低时，析晶也比较快，也会影响产品的纯度；当析晶体系长期处于pH＞3.0时，产品纯度与收率均比较低，分析其原因可能是pH值较高时，头孢母核上的双键可能发生异构，容易产生异构体杂质，影响纯度及收率，也有可能部分游离的头孢洛扎未成盐也会影响收率。对于该反应，使用了有机碱三乙胺调节pH值。考察过使用碳酸钾或碳酸钠等无机碱与二乙胺、三乙胺、哌啶及吡啶等有机碱，具体见表3，结果使用三乙胺时，产品的纯度及收率综合考虑是最佳的。表2 不同pH值对合成头孢洛扎硫酸盐的影响Tab.2 Effect of different pH values on synthesis of ceftolozane sulfatepH值 头孢洛扎硫酸盐的纯度/% 头孢洛扎硫酸盐的摩尔收率/%1.2 95.33 92.25 1.4 98.18 93.12 1.5 99.07 95.02 1.9 98.99 94.75 2.5 99.11 95.00 3.0 99.03 93.97 3.5 94.08 89.26表3 不同碱对合成头孢洛扎硫酸盐的影响Tab.3 Effect of different bases on synthesis of ceftolozane sulfate无机碱/有机碱 头孢洛扎硫酸盐的纯度/% 头孢洛扎硫酸盐的摩尔收率/%碳酸钾 97.16 89.50碳酸钠 96.15 87.32二乙胺 98.73 92.08三乙胺 99.11 95.00哌啶 98.75 89.17吡啶 98.97 90.223 结论以7-位侧链噻二唑化合物TATD为起始原料，与草酰氯反应得到化合物1；再与起始原料母核ACLE·HCl进行缩合反应得到化合物2；然后化合物 2与起始原料侧链吡唑化合物UBT进行反应，并在三氟乙酸/苯甲醚体系下进行脱保护反应得到化合物3；最后经过析晶方式纯化得到头孢洛扎硫酸盐。该工艺得到头孢洛扎硫酸盐的收率较高，所用原料易得，降低了生产成本，纯化时不需要过柱，更适合工业化生产，整个工艺路线具有较大的社会经济效益。参 考 文 献[1] Page M G,Heim J.New molecules from old classes:Revisiting the development of β-lactams[J].I Drugs:Invest Drugs J,2009,12(9):561-565.[2] Sader H S,Farrell D J,Flamm R K,et /tazobactam activity tested against ae-robic Gram-negative organisms isolated from intraabdominal and urinary tract infections in European and United states hospitals:2012[J].J Infect,2014,69(3):266-277.[3] Zhanel G G,Chung P,Adam H,et /tazobactam:A novel cephalosporin/β-lactamase inhibitor combination with activity agai-nst multidrug-resistant Gramnegative bacilli[J].Drugs,2014,74(1):31-51.[4] Moya B,Zamorano L,Juan C,et of a new cephalosporin,CXA-101(FR),against β-lactam resistantPseudomonas aeruginosa mutants selectedin vitroand after antipseud-omonal treatment of intensive care unit patients[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(3):1213-1217.[5] Moya B,Beceiro A,Cabot G,et al.Pan-β-lactam resistance development inPseudomonas aeruginosaclinical strains:Molecular mechanisms,penicillin binding protein profiles,and binding affinities[J].Antimicrob Agents Chemother,2012,56(9):4771-4778.[6] Jonathan C C,Fiorenza M A,Estrada S /tazobactam:A novel cephalosporin/β-lactamase inhibitor combination[J].Pharmacotherapy,2015,35(7):701-715.[7] Ohki H,Okuda S,Yamanaka T,et :WO,[P].2004-05-13.[8] Lai J,Pathare P M,Kolla L,et compositions and methods of manufacture:WO,[P].2014-09-25.[9] Toda A,Ohki H,Yamanaka T,et and SAR of novel parenteral antipseudomonal cephalosporins:Discovery of FR[J].Bioorg Med Chem Lett,2008,18(17):4849-4852.

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